来看如何简单可靠灵敏特异测定HO释
2023/7/30 来源：不详白癜风能光疗吗 http://pf.39.net/bdfyy/bdfjc/140915/4473326.html
该篇实验方法已经在eLife文章“Mesenchymalstromalcellagingimpairstheself-organizingcapacityoflungalveolarepithelialstemcells”中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在Bio-protocol期刊，欢迎大家进入Bio-protocol期刊直接与作者交流。
简介
在这篇Bio-protocol文章中，来自美国伯明翰大学和杜兰大学的研究人员为我们描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的H
O
的方法。
亮点
该方法与目前利用荧光染料检测细胞内H
O
的方法不同，该方法具有特异性和灵敏度，检测范围在纳摩尔范围内。
该方法能够在活细胞、类器官或组织中进行H
O
的快速检测，可以在几分钟到几小时内计算出H
O
的稳态释放速率。
该方法成本低，储存保质期长，相对于商业试剂盒来说更加经济实用。
背景介绍
活性氧（ROS）在自然界中普遍存在，在生物系统中作为信号分子发挥作用，还可能导致几种病理生物疾病状态下的氧化应激。因此，对ROS的研究在生命科学领域至关重要。众所周知，ROS可能来自细胞内多种酶促和非酶促代谢反应。细胞内的细胞器如线粒体、内质网、微粒体和过氧化物酶体都含有产生ROS的酶，且细胞主要通过超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用来对抗过量的ROS。
目前已公认，ROS诱导调节细胞信号转导的蛋白质翻译后修饰，被称为“氧化还原信号”。在过去的25年里，NADPH氧化酶（NOX）家族的发现进一步阐明了氧化还原信号传导领域。这些新型酶的主要催化功能是调节ROS的生成，特别是超氧阴离子（O
.-）和过氧化氢（H
O
）的生成。由于H
O
可以直接影响介导信号转导的蛋白质中易感的硫醇基团，因此H
O
也成为一种关键的信号分子。NOX在生物膜（包括质膜）中的定位使得能够检测活细胞培养物/组织表面的NOX活性。然而，对于H
O
来说，细胞外释放也可能反映细胞内H
O
的产生，这种产生能够跨质膜扩散，或通过水通道蛋白通道运输。
在这篇protocol中，作者描述了一种简单、可靠、灵敏和特异的方法，用于检测和定量活细胞、类器官或组织释放的H
O
。在这个检测体系中，H
O
的的特异性是基于H
O
与含过渡金属的血红素过氧化物（如辣根过氧化物酶HRP）在高速率常数下的高反应活性，生成的中间络合物能够催化一系列取代酚类化合物的二聚化，作者利用高香草酸（-甲氧基-4-羟基苯乙酸，HVA）在H
O
和HRP的存在下转化为强荧光二聚体的特性已成功地检测了NOX4的活性。
步骤节选
stepA.Cell-basedassay
Day1:Seedcells(~50,cells/well)ina24-welltissuecultureplate,in
